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谈谈阴离子交换柱介质及流动相的选择

发布时间:2022-08-09

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  阴离子交换柱介质的选择:
 
  离子交换介质首先要考虑目的分子的大小,因为目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团,因此也会影响介质对目的分子的动力载量,从而影响其分离。
 
  对于大多数纯化步骤来说,建议从开始的阶段使用强离子交换柱,可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于已知等电点的蛋白质,可根据其等电点来选择。而未知等电点的蛋白质,在实际操作中常采用这样的方法,先选择一个阴离子交换剂,再选择一个中性的pH缓冲液,将蛋白质样品透析至pH7.0,然后过阴离子交换柱。根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液pH。
 
  阴离子交换柱流动相的选择:
 
  离子交换色谱的流动相必需是有一定离子强度的并对pH有一定缓冲能力的溶液。为了避免目的蛋白失活,使用缓冲液可稳定流动相的pH,使之在色谱过程中不发生明显变化,同时可稳定目的分子上的电荷量,保证色谱结果的重要性。
 
  选择缓冲液一般按照以下原则:阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液,可用柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸盐等;阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液,可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等;起始缓冲液的浓度应尽可能低(<100mmol/L)这样可以使色谱柱上更多的吸附分离物质;缓冲液应不含会影响被分离物质活性和溶解度成分,洗脱时尽量不采用pH梯度洗脱。
 
  阴离子交换柱的选择:
 
  离子交换色谱通常选用粗短柱,即高径比小的色谱柱。典型的离子交换柱高度在5~20cm,高径比一般小于5。如果需要增加离子交换剂的体积,只能从增加柱的直径而不能增加其高度。如果是连续梯度洗脱,可以适当增加柱的长度。
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